Éra světových šampionátů
Mladého talentovaného jezdce si vyhlédl tým Aprília Sandroni, Valentino s Aprílií spolupracoval na vylepšeních pro model RS125R a následně za tento tým začal závodit ve třídě do 125 ccm. Rossi za Aprílii startoval poprvé v roce 1994 na italském mistrovství (celkově získal šesté místo) a v jejích barvách nastoupil i v následujícím roce: na evropském šampionátu skončil třetí, šampionát Itálie v roce 1995 vyhrál.
V seriálu závodů Velké ceny silničních motocyklů v sezóně 1996 se však Rossimu vůbec nedařilo, několikrát spadl a pět závodů nedokončil. V srpnu však v České republice na brněnském okruhu vyhrál na motocyklu AGV Aprília RS125R svou první Velkou cenu. Celkově nakonec skončil devátý, především kvůli nevyrovnanosti svých výkonů, mnohdy ale překvapoval ohromující rychlostí. Mohlo by se zdát, že v této sezóně se Rossi především učil ovládat svůj motocykl, do začátku následující sezóny však své schopnosti vybrousil do té míry, že si v kubatuře do 125 kubických centimetrů s přehledem dojel pro titul mistra světa. Vyhrál jedenáct z patnácti závodů.
S trochou nadsázky by se dalo říct, že v sezóně 1998 byla Aprília takřka navrcholu, mohla se totiž pyšnit nejen modelem RS250, ale i jezdci takových kvalit, jako byli Valentino Rossi, Loris Capirossi a Tetsuya Harada. Jenže ani rychlý motocykl a zkušení týmoví kolegové Rossimu příliš nepomohli. Celou jeho první sezónu ve třídě 250 ccm ho provázely problémy a obtíže a Rossi tento rok považoval za nejtěžší v celé své kariéře. Tlak na něho vyvíjela nejen Aprílie, která od něho očekávala vynikající a bezchybné výkony, ale také média a v podstatě všichni v jeho okolí. Na o něco horších výsledcích se zřejmě podepsal i fakt, že při automobilové havárii zemřeli dva jeho blízcí přátelé. V celkovém pořadí se ale Rossi nakonec umístil na druhém místě, o pouhé tři body za Lorisem Capirossim. V roce 1999 si už titul uniknout nenechal. Cestou posbíral pět pole position a zvítězil v devíti Velkých cenách.
Za titul v kubatuře do 250 ccm byl Rossi v roce 2000 odměněn nabídkou týmu Honda závodit za ni v tehdy nejvyšší třídě závodů silničních motocyklů – 500 ccm. Jeden ze členů nejvyššího vedení Hondy, Jeremy Burgess, tehdy pro Rossiho vybral model NSR500. Byl přesvědčen, že bude-li tento motocykl řídit právě Valentino Rossi, nemůže to skončit ničím jiným než úspěchem. Během prvního roku u Hondy měl Rossi velmi dobré zázemí, jeho osobním poradcem byl bývalý několikanásobný světový šampión ve třídě 500 ccm Mick Doohan. I s tím dříve Jeremy Burgess spolupracoval. Do této doby spadá také počátek rivality mezi Rossim a Maxem Biaggim, který byl tehdy v pětistovkách nepochybně mužem číslo jedna. Ačkoli se spolu tito dva jezdci nikdy dřív nestřetli přímo na okruhu, během krátké doby bylo jasné, že rádi se mít rozhodně nebudou. Vzájemná rivalita z nich doslova čišela. Arogance spojená s lehkomyslnou přívětivostí v podání Rossiho narážela na pyšnou povahu Biaggiho, který si tehdy myslel, že je středem vesmíru. Média samozřejmě s chutí přikládala polínka do ohně jejich sporů a otiskovala každičkou pikantní zprávu, co se jim donesla k uším, ať už byly informace potvrzené, nebo šlo o pouhou domněnku. Rossi postupně odhaloval všechny silné stránky motocyklu NSR500 a svými nápady i nadále přispíval k jeho vylepšování. Trvalo to devět velkých cen, než Valentino Rossi poprvé stanul na nejvyšším stupínku stupňů vítězů, všem ale bylo jasné, že stejně jako v obou nižších kubaturách bude i tentokrát první sezóna víceméně testovací a čas tohoto jezdce přijde v sezóně následující. Rossi nakonec v celkovém pořadí skončil druhý, zvítězil Kenny Roberts Jr a Max Biaggi se musel spokojit s místem třetím.
Světovému šampionátu v roce 2001 už Rossi dle očekávání kraloval, zvítězil v 11 velkých cenách, včetně prvních tří a posledních čtyř. Touto sezónou však éra pětistovek končila, a to nejen pro Rossiho, ale pro všechny jezdce. Od roku 2002 se z ní stala královská třída MotoGP, ve které jezdci začali závodit na motocyklech o dvojnásobném objemu.
V roce 2001 Rossi navíc zahájil spolupráci s americkým jezdcem Colinem Edwardsem. Na motocyklech Honda VTR1000SPW se zúčastnili vytrvalostního závodu Suzuka 8 Hours a navzdory tomu, že Rossi neměl se superbiky téměř žádné zkušenosti, v tomto závodě zvítězili.